Hedeflenmiş nükleazlar genlerin hassas ölçüde değşitirilebilmesi için güçlü araçlardır. Crispr-Cas sistemi RNA-rehberli nükleazlar ile yabancı genetik elementleri kesmek için kullanılan bir mikrobiyal adaptif immün sistemdir. 3 çeşit CRISPR mekanizması bulunmuştur. Ancak bunlardan Tip II en çok çalışılanıdır. Bu tipte, virüs DNA’sı ya da plazmid küçük fragmentlere kesilerek CRISPR lokusunun ortasında yaklaşık 20 baz çiftlik kısa tekrarlara katılır. Lokus transribe edildikten sonra, transkriptlerden küçük CRISPR RNA (crRNA) oluşturulur. Bunlar, daha sonra hedef DNA’nın sekans eşleşmesine göre effektör endonükleazlara öncülük etmesi için kullanılır.
Cas proteininin (Cas 9=Csn1) knockdown ve kurtarma deneylerinde özellikle Tip II CRISPR sisteminde anahtar protein olduğunu söyleyebiliriz. Tip II sistemlerde, Cas9 crRNA’ların işlenme sürecine katılır ve hedef DNA’nın yok edilmesinden sorumludur.
Bölgeye spesifik DNA tanınmasını ve kesilmesini sağlamak için, Cas9’un crRNA ve tracrRNA ile karşılaşması gerekir. tracrRNA için, crRNA’dan kodlanan çoklu pre-crRNA’ların birincil transkriptlerinden maturasyon gereklidir. Bunun için RNazIII ve Cas9’a ihtiyaç duyulur. Hedef DNA’nın yok edilmesi için, HNH ve RuvC’ye benzer nükleaz domainleri her iki DNA ipliğini keserek, 20 nükleotitli hedef dizide crRNA transkripti ile ilişkilendirilmiş çift iplikli kesimler yaratır. HNH domaini komplementer zinciri keserken, RuvC komplementer olmayan zinciri keser.
Cas9’un çift iplikli endonükleaz aktivitesi kısa korunmuş sekans gerektirir ve bu sekansa (2-5 nükleotitten oluşan) PAM denmektedir. PAM sekansı olmadığında, Cas9 RNA’sı komplementer sekansı tanımaz.
Moleküler Biyolojide Bir Teknik Olarak Cas9 ve CRISPR
Tip II CRISPR sistemi 3 bileşene ihtiyaç duyar: crRNA, tracrRNA ve Cas9. Bu sistemin basitliği birçok genom düzenleme applikasyonuna adaptasyonunu sağlamıştır. Bu potansiyel 2012’de Doudna ve Charpentier’in araştırma laboratuvarlarında farkına varılmıştır. Daha önce bahsedilen Tip II CRISPR sistemine istinaden, araştırmacılar tracrRNA ve crRNA’yı kombine eden iki bileşenli sistemi basitleştirerek tekli sentetik rehber RNA’ya (sgRNA’ya) dönüştürmüşlerdir. Bu sgRNA tarafından programlanmış Cas9 sisteminin, Cas9 ile programlanmış ayrı ayrı tracrRNA ve crRNA kullanan sistem kadar hedef genlerde effektif değişiklikler yaptığı bulunmuştur.
Şimdiye kadar genom düzenleme protokollerinde Cas9 nükleazın 3 farklı varyantı adapte edilmiştir. Birincisi olan wild-type Cas9, bölgeye spesifik olarak iki iplikle DNA’yı kesebilmektedir. Bunun sonunda, double strand break (DSB) sistemi aktive olmaktadır. Non-homologous end joining (NHEJ) yolağı ile düzeltilen DSB’ler insersiyon ve delesyona sebep olarak hedef lokusu parçalamaktadır.
Cong ve araştırma ekibi bu sistemi bir adım öteye taşıyarak, Cas9D10A olarak bilinen mutant form Cas9 ile sistemin hassasiyetini artırmışlardır. Bu sistemde, sadece bir DNA zinciri kesilerek NHEJ sistemi aktive edilmemektedir. DNA tamiri HDR yolağı ile olduğu için daha az indel mutasyonları oluşmaktadır.
Üçüncü varyant ise nükleaz olmayan Cas9’dır (dCas9). HNH domainindeki H840A mutasyonları ve RuvC domainindeki D10A mutasyonları kesme aktivitesini bitirir ve bu şekilde DNA bağlanmasını önlemez. Bu yüzden bu varyant, genomun herhangi bir bölgesinde sekansa spesifik hedef yapılması istenen moleküler biyoloji deneylerinde kullanılır. Gen susturma ve aktivasyon deneyleri için önemli bir araçtır.
Kaynaklar
Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., … & Zhang, F. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., & Charpentier, E. (2012). A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821.
İlk yorum yapan olun